Po končani gimnaziji v Novem mestu, je nadaljeval šolanje v Ljubljani, kjer je leta 1839 vpisal bogoslovje in po dveh opravljenih letnikih že odpotoval v Rim. Priglasil se je papeškemu uradu za širjenje vere v poganskih deželah in doživel hladen tuš, kajti vodstvo urada je zavrnilo njegovo prošnjo za vpis. V neznanem mestu se je čez noč znašel na cesti, z malo denarja in nekaj osebne prtljage. Kakor je kasneje večkrat dejal, mu je bila ta izkušnja zelo potrebna in pozneje se je lahko zoperstavil tudi najhujšim oviram.
Denarna pomoč, ki so mu jo pošiljali domači podporniki, ljubljanski knezoškof Anton Alojzij Wolf in rojak z Bučke, duhovnik Jožef Partelj, Knobleharja ni odvrnila od tega, da je čez poletje 1842 sprejel delo zasebnega učitelja in vzgojitelja pri družini Paulsen. Z njimi je odpotoval v Kopenhagen in se v Rim vrnil šele pozno jeseni.
Kljub temu, da ni bil sprejet na redni študij, se je z vodstvom Kongregacije za širjenje vere, krajše Propagando, uspel dogovoriti, da obiskuje predavanja tujih jezikov. Na francoski kraljevi akademiji je poslušal predavanja iz astronomije, geodezije in slikarstva, v jezuitskem zavodu pa so mu dovolili prisostvovati pouku medicine in naravoslovja. Vsa znanja je kasneje s pridom izkoristil pri svojem raziskovanju Nila in ljudstev ob njem. Kardinal in varuh papeške knjižnice Giuseppe Mezzofanti, velik italijanski poliglot, je v Knobleharju prepoznal nadarjenost za učenje tujih jezikov. Pri vodstvu Propagande se je zavzel zanj in poleti leta 1843 je bil Knoblehar sprejet na redni študij. Knoblehar se mu je oddolžil tako, da je Mezzofantija učil slovenščino. Sredi meseca marca 1845 je opravil novomašniško posvečenje. Z vztrajnostjo in pridnim učenjem pa si je pridobil tudi doktorski naziv iz teoloških ved.
