S pomočjo Dunajskega geografskega društva (Geographische Gesellschaft Wien), ki mu je po obisku Evrope leta 1850 priskrbelo vse potrebne merilne inštrumente, in katerega častni član je postal leta 1857, je naredil več prvenstvenih odprav po Nilu. Med prvimi se je lotil načrtnih hidroloških raziskav reke, s poročili, ki jih je pošiljal v Evropo, pa je ponovno obudil razpravo o njenih izvirih. Pravilno je sklepal, da je izvir Nila potrebno iskati pod ekvatorjem. Močno si je prizadeval, da bi ga dosegel sam, toda prezgodnja smrt mu je to preprečila.
Med bivanjem v Sudanu je Knoblehar opravil šest potovanj po Nilu in v desetih letih kar štiri leta in pol preživel na reki. Na svoji posebni, z železom okovani ladji imenovani Stella Matutina (Jutranja zvezda), se je počutil kot doma in razdalja okoli 1600 kilometrov med Kartumom in Gondokorom se mu ni zdela nič posebnega.
Bil je prvi raziskovalec, ki je sistematično beležil podatke o velikem afriškem vodotoku, opisoval je rečno obrežje in otoke ter zapisal številne zanimivosti o različnih ljudstvih. V Avstrijski narodni knjižnici na Dunaju hranijo Knobleharjev ladijski dnevnik s prvega potovanja, v istem zvezku pa so opisana tudi potovanja v letih 1853, 1854 in 1857. V maju 1854 je prispel skoraj do tretje stopinje severne zemljepisne širine. Nameraval je napisati znanstveno razpravo o Belem Nilu in južnem Sudanu, a mu to žal ni uspelo. Leta 1857 se je zaradi slabega zdravstvenega stanja vrnil v Evropo. Prišel je do Neaplja, kjer je zaradi izčrpanosti 13. aprila 1858 umrl. Pokopan je v samostanu bosih avguštincev, kjer so mu slovenski rojaki leta 2019 ob 200. obletnici rojstva postavili spominsko ploščo.
Njegovo učenost so občudovali mnogi raziskovalci, ki so se srečali z njim. Zelo dobro je poznal naravno okolje Belega Nila, njegovo hidrografsko znanje je visoko cenil Francoz Ferdinand Lesseps, kasnejši graditelj Sueškega prekopa; nemški naravoslovec Alfred Brehm je bil navdušen nad Knobleharjevimi izvrstnimi znanstvenimi zapiski; ameriški popotnik in pisatelj Bayard Taylor pa je leta 1854 v New Yorku objavil odmeven potopis in v njem izpostavil Knobleharjeve opise Belega Nila. Sloves slovenskega misijonarja je segel celo do francoskega pisatelja Julesa Verna, ki ga je omenil v pustolovskem romanu Pet tednov v balonu. Prizor je postavljen v elitni popotniški klub The Traveller’s Club na londonskem Pall Mallu, kjer priredijo zdravico v čast najslovitejšim raziskovalcem Afrike. S francoskih vinom med drugim nazdravijo tudi v spomin na Knobleharja.
